• A
  • A
  • A
  • АБВ
  • АБВ
  • АБВ
  • А
  • А
  • А
  • А
  • А
Обычная версия сайта

Исследование адгезии бактерий в микрофлюидной модели кишечного барьера человека

2019–2020

Основными целями настоящего проекта являются: 1. Моделирование кишечного барьера человека in vitro для изучения процессов колонизации эпителиального слоя бактериями в реальном времени. 2. Разработка малоинвазивной методики и эксперементального устройства, которые позволяют проводить мониторинг адгезии бактерий и отслеживать их состояние в процессе взаимодействия с эпителиальным слоем человеческих клеток в условиях микрофлюидного чипа. Разработанный прибор и методика позволят проводить лабораторные исследования адгезии отдельных бактерий, а также микробиома человека в целом, как в научно-исследовательских целях, так и, в перспективе, в медицинских учреждениях.
Основные результаты:

Оценка инфекционного потенциала различных штаммов бактерий в организме путем анализа их адгезивных свойств и резистентности к антибактериальному воздействию, является важной частью микробиологической практики в современных медицинских учреждениях. В настоящее время наиболее распространенным методом исследования адгезивных свойств бактерий является рутинная лабораторная практика по оценке степени адгезии бактерий на клеточных культурах после нескольких последовательных промывок и титрований с использованием иммуноцитохимического окрашивания, фотоколориметрических методов, проточной цитометрии, флуоресцентной микроскопии и прочих методов цитотоксикологического исследования. Это крайне трудозатратный и долгий процесс, требующий вовлечения значительных ресурсов и персонала. В настоящее время на смену подобным лабораторным методам приходят экспериментальные модели в микрофлюидных чипах. Принципиальным преимуществом чипов является возможность скрининга в режиме реального времени молекулярных процессов при адгезии бактерий к клеточному образцу при сокультивировании различных клеток.

В рамках первого этапа были выполнены следующие работы:

1. Проведение аналитического обзора современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей решаемую проблему.

2. Проведение патентных исследований.

3. Теоретические и/или экспериментальные исследования для выбора оптических методов для мониторинга процессов бактериальной адгезии и колонизации в реальном времени.

4. Теоретические и/или экспериментальные исследования для выбора подходов к созданию прототипа устройства для мониторинга процессов бактериальной адгезии и колонизации в реальном времени.

5. Разработка оптической схемы прототипа устройства для мониторинга процессов бактериальной адгезии и колонизации в реальном времени.

6. Теоретические и/или экспериментальные исследования для выбора подходов к моделированию взаимодействия бактерий с моделью кишечного барьера человека.

7. Теоретические и/или экспериментальные исследования для выбора подходов к анализу экспериментальных данных.

8. Выбор и культивирование клеточной линии, предназначенной для моделирования кишечного барьера человека.

9. Создание банка образцов клеточной линии, предназначенной для моделирования кишечного барьера человека.

10. Разработка дизайна сенсорной системы для измерения рамановских спектров бактерий (art photonics GmbH совместно с Датским национальным институтом метрологии).

11. Разработка макета специального оптического световода, позволяющего детектировать оптические характеристики бактерий в условиях in situ и in vitro (art photonics GmbH совместно с Датским национальным институтом метрологии).

12. Разработка процедуры работы с сенсорной системой для измерения рамановских спектров бактерий (art photonics GmbH совместно с Датским национальным институтом метрологии).

13. Разработка списка возможных применений сенсорной системы (art photonics GmbH совместно с Датским национальным институтом метрологии).

14. Разработка архитектуры программного обеспечения для работы с сенсорной системой для измерения рамановских спектров бактерий (art photonics GmbH совместно с Датским национальным институтом метрологии).

На первом этапе проекта проведен анализ патентов и научно-технической литературы, относящейся к разрабатываемой теме для оценки мирового уровня разработок по теме и конкурентоспособности предполагаемого продукта исследований. Создание таких моделей как «орган-на-чипе» и их дальнейшее развитие в модель «кишечник-на-чипе» с возможностью сокультивирования вместе с бактериальными клетками, являются большим прорывом в научной сфере, который в перспективе позволит решать крайне сложные научно-медицинские задачи, которые раньше могли казаться совсем невозможными. Возможность создания модели «человека-на-чипе» в будущем позволит проводить скрининг лекарственных молекул и изучать лекарственные средства с высокой точностью и без участия самих людей как объектов исследования, кроме того подобные системы могут лечь в основу персонифицированной медицины. И, следует отметить, что до недавнего времени персонифицированная медицина имела только один важный вектор развития – онкология. Но с открытием новых данных о микробиоме появляется так же и второе направление – персонифицированная гастроэнтерология. Наиболее подходящими для мониторинга процессов бактериальной адгезии и колонизации в реальном времени являются рамановская спектроскопия или флуоресценция. Использование комбинационного рассеяния позволяет получить большее количество информации об исследуемых бактериях, однако сопряжено с техническими сложностями в первую очередь связанными со слабостью получаемого сигнала. Использование металлических поверхностей или наночастиц невозможно по уже описанным выше причинам. Использование как локального поверхностного, так и когерентного анти-стоксового методов усиления сигнала сопряжены с техническими сложностями и требуют использования дорогостоящего оборудования. Кроме того, существует риск того, что сигнал от клеток, моделирующих стенку кишечника будет перекрываться с сигналом, который дают бактерии в силу наличия в них сходных белков. В то же время, флуоресцентные методы позволяют проводить измерения неинвазивным образом в режиме реального времени, получая изображения с хорошим пространственным разрешением при относительно невысокой стоимости оборудования. Для обработки полученных данных доступно большое количество разнообразных программных средств. Исходя из всего вышеперечисленного, использование флуоресцентных методов выглядит наиболее подходящим для решения поставленной задачи, соответственно, оптическая система мониторинга адгезии и колонизации, входящая в прототип устройства, должна базироваться на флуоресценции. На основании проведенного исследования по выбору оптимальных оптических методов для мониторинга процессов бактериальной адгезии и колонизации в реальном времени была спроектирована оптическая схема прототипа устройства длямониторинга процессов бактериальной адгезии и колонизации в реальном времени. Оптическая схема позволяет записыватьспектры флуоресценции выбранной области клеточной модели. Она также позволяет проводить микрофотосъемку как в белом свете, так и во флуоресцентном режиме. Наиболее перспективными для исследования взаимодействий микробиота-кишечник являются модели, в основе которых лежит сокультивирование эндотелиальных и эпителиальных клеток кишечника с микробиотой на микрофлюидном чипе. Такие модели получили название кишечник-на-чипе. В условиях постоянного динамического потока клетки колоректальной аденокарциномы человека Caco2, наиболее часто используемые в качестве модели эпителиальных клеток кишечника, подвергаются дифференцировке, которая сопровождается следующими изменениями в фенотипе: на их поверхности появляются ворсинки, они начинают продуцировать слизь, которая покрывает апикальную поверхность образуемого эпителия. Кроме того, постоянная циркуляция жидкости сдерживает активный рост микроорганизмов, за счет чего обеспечивая более длительную выживаемость клеток.

Было выбрано несколько подходов к к анализу экспериментальных данных: ImageJ, Fiji, Oufti, ColiCoords и SuperSegger.

Для моделирования клеточного эпителия была выбрана клеточная линия Caco-2. Был создан банк клеточной линии Caco-2. Выход клеток составил тридцать виал, содержащих по 250 000 клеток в каждой, замороженных года на двадцатом пассаже.

Совместно с иностранными партнерами был разработан макет системы для обнаружения бактерий. Разработанный сенсор сократит время обнаружения, и благодаря этому позволит вмешиваться в процесс распространения на более ранних этапах. Основным преимуществом BacSens является обнаружение на месте патогенных бактерий в режиме реального времени. Инновационность BacSens заключаются в сочетании спектроскопической технологии с методикой обнаружения бактерий по типу отпечатков пальцев. Эта технология дает BacSens ключевое преимущество в том, что он быстрее и надежнее по сравнению с существующими методами и устройствами для бактериального скрининга. Спектроскопическое решение BacSens обеспечивает технологическое и коммерческое преимущество, заключающееся в том, что устройство сможет быстро предупредить о наличии патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам. По сравнению с методами, которые в настоящее время используются в больницах, а именно трудоемким и требующим времени тестированием в лабораториях, BacSens позволяет улучшить следующие характеристики:

  • Скорость: результат анализа на месте будет доступен сразу
  • Охват: из-за сложности лабораторного метода, он применяется только тогда, когда есть подозрение на присутствие патогенныхбактерий. Измерение на месте будет использоваться для более широкой выборки людей, и таким образом будет возможно провести более качественный скрининг на патогенные бактерии
  • Цена и обработка. Текущие ручные методы обнаружения основаны на трудоемком отборе проб и лабораторном анализе, который занимает много времени и стоит около 75 евро за один тест. Окупаемость сенсорной системы будет достаточно быстрой.
  • Универсальность, поскольку прибор может работать с любыми новыми биологическими объектами, таким как новые бактерии или вирусы

Выводы из патентных исследований:

В результате выполнения патентных исследований по данной тематике проанализирован объемный массив информации, включающий 185 патентных документов, что безусловно свидетельствует о высокой степени интереса к области исследования со стороны субъектов рынка во всем мире. Подводя итог анализу патентных публикаций, относящихся к микрофлюидным моделям кишечного барьера человека, предназначенным для исследования адгезии бактерий, можно выделить несколько основных направлений развития соответствующих технических решений. Одним из таких направлений является совершенствование элементов микрофлюидных систем, от жидкостных до измерительных элементов, в том числе систем электродов и средств определения импеданса. Следует отметить, что при формировании электродов в микрофлюидной системе, помимо традиционных подходов, активно внедряются инновационные методы, позволяющие формировать электродные структуры с суб-микрометровыми размерами. Кроме того, применение полимерных оптически прозрачных электродов также набирает популярность благодаря возможности их применения в комбинации с оптическими средствами мониторинга. Второе направление охватывает развитие целых микрофлюидных систем, отвечающих описанному выше спектру задач. Данное направление составляют оригинальные подходы к организации структуры микрофлюидной системы (в том числе, в случае узкой направленности на решение конкретных прикладных задач) и реализации способов ее изготовления. Направление также включает в себя обширный пласт, включающий микрофлюидные сенсоры и измерительные системы, в том числе направленные на исследование модели кишечного барьера человека. Третье направление развития объекта настоящего исследования формируют технические решения, осуществляющие моделирование на базе микрофлюидных систем, а также управление такими системами и их мониторинг. Проведенный поиск показал, что одной из наиболее популярных моделей является модель кишечного барьера человека на основе микрофлюидной системы. Таким образом, проведенный анализ найденных публикаций свидетельствует о том, что на сегодняшний день ведутся активные исследовательские работы по тематике исследований, что подтверждает актуальность данных работ и перспективность дальнейшего совершенствования исследуемого объекта техники.

Коды по классификатору Elibrary:
62.33.31 Культивирование клеток и тканей человека и животных